《Kreyasyon yon metòd deteksyon micropterus salmoides rhabdovirus ki baze sou CRISPR CAS13A System Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dann Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang Qing etablisman nan yon metòd deteksyon pou gwo bouch yo ki gen pouw vle di pou yo fè yon ti kras. Chinwa Journal of Hydrobiology, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
Micropterus Salmoides, ke yo rele tou California Bass oswa Ameriken Nwa Bass, se yon pwason dlo dous natif natal nan Amerik di Nò. Nan dènye ane yo, li te vin yon pwason enpòtan kiltive atravè lemond paske nan demann mache segondè li yo: Micropterus Salmoides gen vyann fèm, kèk zo, gou bon gou, nitrisyon rich, espesyalman pwoteyin segondè ak grès ki ba, ki satisfè demand konsomatè yo pou manje ki an sante. Se poutèt sa, pri sou mache a se relativman wo epi li se souvan yo itilize nan mache a-wo fen Restoration. Kwasans vit: Micropterus salmoides ap grandi byen vit epi yo ka jeneralman rive nan espesifikasyon komodite nan 6-8 mwa. Li apwopriye pou elvaj kout-sik ak ka byen vit reyalize retounen envestisman. Bonjan rezistans maladi: Konpare ak lòt pwason kiltive, salmoides micropterus gen gwo adaptabilite nan anviwònman an, mwens gwo-echèl epidemi maladi, ak diminye risk elvaj. Elvaj ekolojik: Largemouth Bass ka melanje ak lòt pwason dlo dous tankou karp ajan ak karp zèb, ki ede reyalize letan balans ekolojik ak maksimize itilizasyon resous, plis amelyore efikasite elvaj ak lòt faktè. Li se akeyi pa dine ak kiltivatè akwakilti, ak echèl elvaj li yo te grandi rapid nan dènye ane yo.
Malgre ke micropterus salmoides yo relativman maladi ki reziste, yo ka toujou soufri soti nan kèk maladi nan kondisyon elvaj pòv yo. Pami yo, micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV) se trè danjere: li te premye dekouvri nan Florid, USA nan lane 1991. Viris la te okòmansman detekte nan popilasyon largemouth bass, ak Lè sa a, piti piti gaye nan lak dlo dous ak rezèvwa nan Etazini yo, vin youn nan patojèn prensipal yo nan largen nan men yo.
Sentòm klinik pwason malad
A: Healthy largemouth bas, flèch la endike sak la jònze; B: Bass largemouth malad, flèch la endike sak la jònze.
Se sous la nan transmisyon souvan enfekte fri oswa pwason granmoun, kò dlo polye, ak pwason nan bwa pote viris la; Viris sa a ka transmèt nan kontak dirèk, eskresyon fekal, ak kò dlo, epi li gen plis chans rive anba bon jan kalite dlo pòv oswa kondisyon elvaj segondè-dansite. difizyon. Viris la ka lakòz letaji, pèdi wout, anfle nan vant ak deformation kò nan pwason jivenil, osi byen ke pwovoke maladi ilsè necrotic ak milti-ògàn senyen. Yon fwa enfekte, to mòtalite a depase 90%.
Sentòm klinik nan atifisyèlman enfekte micropterus salmoides
A: Healthy largemouth bas; B, C, D: atifisyèlman ki enfekte largemouth bas.
Chak ane, plis pase 30% nan micropterus salmoides fri yo pèdi akòz MSRV. Kounye a, metòd tretman ak deteksyon pou viris la toujou imatur, e pa gen okenn medikaman espesifik pou trete li. Se poutèt sa, li trè nesesè yo detekte viris la nan tan anvan enfeksyon ak pran mezi efikas prevantif, ki ka diminye pèt yo nan pwosesis la elvaj nan yon sèten limit;
Anplis de sa, li difisil a pote soti sou-sou sit deteksyon san yo pa ekipman deteksyon konplèks ak teknoloji deteksyon ki egziste deja. Nan fè fas a defi sa a, ekip rechèch la nan Sid peyi Lachin Agrikòl Inivèsite te devlope yon nouvo metòd deteksyon konbine MIRA ak CRISPR-sistèm. Metòd sa a gen fò espesifik, segondè sansiblite ak operasyon senp, ki anpil amelyore efikasite nan deteksyon nan MSRV ak tou ede yo detekte MSRV pi bonè posib epi pran prevansyon ak mezi kontwòl.
Mira Jadendanfan konbinezon tès depistaj
De pè nan prime MIRA diferan yo te itilize yo anplifye fragman nan jèn ki gen sekans lan sib, ak pwodwi yo anplifye yo te sibi elèktroforèz jèl agarose. Te graf la elèktroforèz ki sitiye nan pozisyon an nan 100 bp, ak Gwoup Mizik klere parèt nan tout twa liy yo, ki endike ke te gen pwodwi ki pa espesifik anplifikasyon. Gwoup yo sib anplifye nan 250 bp nan liy 2 ak 3 yo te respektivman kantitativman analize pa lojisyèl imaj J, ak rezilta yo nan analiz la quantitative yo te eksprime pa "valè gri". Soti nan rezilta yo analiz, li kapab konkli ke pi ba a valè a gri, pi wo a Jadendanfan pousantaj la itilizasyon, se sa ki, ki pi wo a Jadendanfan espesifik efikasite nan anplifikasyon obligatwa.
Rezilta yo te montre ke espesifik efikasite nan anplifikasyon obligatwa te wo lè yo te MIRA-F2/R2 Jadendanfan pè a.
Mira Jadendanfan pè tès depistaj elèktroforèz imaj jèl ak gri analiz valè
a. Lane elèktroforèz M: 2000 BP ADN makè; Elèktroforèz liy 1. negatif ADN echantiyon anplifikasyon; Lane elèktroforèz 2. b. Band gri analiz valè (jan yo montre nan bwat la)
CRISPR/CAS13A Deteksyon Sistèm
Apre reyaksyon an nan sistèm deteksyon CRISPR/CAS13A konplete, li se iradyasyon ak limyè iltravyolèt yo obsève rezilta yo.
CRISPR/CAS13A Deteksyon Sistèm-Fluoresans Klere Dyagram
1-3. Tout sistèm lan ak RNA estanda te ajoute; 4. Pa gen crrna te ajoute; 5. Pa gen pwoteyin Cas13a te ajoute; 6. Pa gen ssRNA repòtè pwofonde te ajoute; 7. Kontwòl negatif
CRISPR/CAS13A-MSRV Sistèm reyaksyon optimal
Nou fè eksperyans lè l sèvi avèk RNA estanda ak anplifye echantiyon RNA. Vitès la pwezante nan RNA a sib te pi bon ak crRNA2 pase ak crRNA1. CRRNA1 te gen yon pi fò siyal fluoresans final pase crRNA2. Itilizasyon melanje CRRNA 1+ CRRNA2 nan pwopòsyon egal te kapab konbine avantaj ki genyen nan tou de epi reyalize pi bon efikasite reyaksyon.
Optimize kondisyon reyaksyon CRISPR/CAS13A-MSRV ak rezilta deteksyon
a. Konparezon nan rezilta deteksyon nan RNA estanda lè l sèvi avèk CRRNA ak sekans espasan diferan;
b. Konparezon nan done siyal fluoresans nan RNA estanda detekte avèk sistèm nan deteksyon nan tanperati diferan;
c. Konparezon nan done siyal fluoresans nan estanda RNA detekte lè l sèvi avèk RNA repòtè sond ak konsantrasyon diferan;
d. Konparezon nan rezilta deteksyon nan estanda RNA detekte lè l sèvi avèk CAS13A/CRRNA konplèks pwofonde ak rapò konsantrasyon diferan;
Pou eksplore efè tanperati reyaksyon an sou sistèm deteksyon an, yo te mete tanperati reyaksyon diferan nan 31 degre, 34 degre, 37 degre ak 41 degre. Tanperati reyaksyon optimal nan sistèm deteksyon CRISPR/CAS13A-MSRV te 37 degre.
Pou eksplore efè konsantrasyon sondaj ssRNA repòtè sou sistèm deteksyon an, nan seri tès la, yo te entansite a fluoresans pozitivman Koehle ak ssRNA repòtè konsantrasyon an pwofonde. Efè deteksyon an nan konsantrasyon sond repòtè ssRNA pa te anpil diferan nan 500-700 nmol/L. Lè ou konsidere pwoblèm ekonomik aktyèl yo, pi bon konsantrasyon sondaj ssRNA repòtè a te 500 nmol/L.
Pou eksplore efè a nan diferan CAS13a ak rapò konsantrasyon reyaksyon CRRNA sou sistèm nan deteksyon, lè rapò a nan CAS13A: CRRNA te 4: 1 ak 3: 1 ki baze sou rapò a nan 100 nmol/L pou chak pòsyon, CAS13a rive nan saturation; Lè kantite lajan an nan CAS13a te konstan, entansite a nan siyal la fluoresans pa te pozitivman Koehle ak ogmantasyon nan kantite lajan an nan crRNA. Se poutèt sa, lè rapò a nan CAS13a CRRNA se 2: 1, CRISPR/CAS13A-MSRV sistèm nan deteksyon ka reyalize aktivite deteksyon maksimòm.
Evalyasyon sansiblite
Yo nan lòd yo eksplore konsantrasyon nan deteksyon minimòm nan MSRV pa CRISPR/CAS13A-MSRV sistèm nan deteksyon, yo te estanda a RNA dilye 10 fwa nan yon seri ak detekte avèk CRISPR/CAS13A-MSRV sistèm nan deteksyon. Sistèm deteksyon CRISPR/CAS13A-MSRV ka detekte omwen 100fm MSRV sib RNA. Lè konsantrasyon nan RNA sib se pi ba pase 100fm, siyal la fluoresans detekte avèk machin nan se pa siyifikativman diferan de sa yo ki an kontwòl la vid. Se poutèt sa, CRISPR/CAS13A-MSRV sistèm nan ka detekte omwen 100fm nan MSRV ssRNA.
Evalyasyon espesifikite nan sistèm deteksyon CRISPR/CAS13A-MSRV pou MSRV
Egzanp tès yo
Pou echantiyon pwason malad ak siy evidan nan maladi ranmase nan fèm lanmè bas, nou verifye si wi ou non patojèn ki enfekte pa pwason an malad te MSRV. Nou itilize prime espesifik nan sekans nan pwoteyin kapsid MSRV pou anplifikasyon PCR, epi li voye Gwoup Mizik ki koresponn lan nan dyagram nan elèktroforèz pou fè tès la. Apre konparezon, nou konfime ke li te MSRV.
Konfimasyon enfòmasyon sekans MSRV
a. PCR anplifikasyon nan 228 bp pwodwi bann nan MSRV prime; b. Sekans pwoteyin MSRV kapsid konpare ak NCBI, sekans fonse yo en ak en sit obligatwa Jadendanfan, ak zòn fonse yo se kote sib pou CRISPR/CAS13A-MSRV CRRNA1 obligatwa
Echantiyon pwason yo malad ki enfekte ak MSRV yo te pretrate ak preamplified pou RNA viral, ak Lè sa a, teste ak gwoup la kontwòl negatif. An menm tan an, yo te cDNA a nan echantiyon yo extrait pou konparezon ak QPCR konvansyonèl yo. Echantiyon yo pozitif (No 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 ak 15) detekte avèk CRISPR/CAS13A-MSRV sistèm nan deteksyon yo te menm jan ak rezilta yo nan QPCR konvansyonèl yo, kote valè a CQ nan qPCR te ant 18 ak 25; Pandan ke nimewo a sik papòt nan echantiyon negatif (No 1, 2, 4, 5, 9, 10 ak 11) te pi gran pase 38, ki endike ke echantiyon yo pa t 'pote viris MSVR. An rezime, done yo deteksyon nan CRISPR/CAS13A-MSRV sistèm nan deteksyon ak konvansyonèl RT-qPCR a te konsistan, ki endike ke CRISPR/CAS13A-MSRV sistèm nan se posib epi yo ka ranplase orijinal la ak metòd deteksyon konplike nan yon sèten limit.
Tablo konparezon vètikal nan echantiyon done deteksyon qPCR ak qPCR ak CRISPR
a. Deteksyon qPCR nan MSRV klinik echantiyon papòt dyagram nimewo sik; Te nimewo a sik echantiyon detekte konpare ak nimewo a sik referans negatif lè l sèvi avèk t-tès analiz (** p<0.01);
b. CAS13A konbine avèk deteksyon MIRA nan MSRV echantiyon echantiyon fluoresans dyagram; Valè a detekte fluoresans echantiyon te konpare ak valè a referans negatif fluoresans lè l sèvi avèk t-tès analiz (** p<0.01)
An rezime, metòd deteksyon CRISPR/CAS13A-MSRV ki etabli nan etid sa a pa egzije enstriman eksperimantal chè, ki fè deteksyon sou sit vit, egzat ak pratik. Se poutèt sa, si se metòd deteksyon sa a itilize alè dekouvri MSRV nan pwosesis la elvaj aktyèl ak pran mezi vize ak efikas, li ka anpil diminye pèt yo ki te koze pa maladi nan pwosesis la elvaj. Anplis de sa, metòd deteksyon sa a se vit, trè sansib ak espesifik, e li gen gwo aplikasyon ak kandida pwomosyon.