Kontwòl ki ka kontwole aktivite Cas12 ankouraje deteksyon inivèsèl ak rapid yon sèl-po asid nikleyik
Pibliye pa: University of Syans ak Teknoloji nan Lachin
Journal: Nature Communications
Faktè enpak: 14.7
Sèvi ak teknoloji MIRA, yo te devlope yon metòd inivèsèl yon sèl-po fliyoresan deteksyon asid nikleyè (SONDAJ) ki baze sou eparin sodyòm. Etid yo montre ke eparin sodyòm ka kontwole aktivite klivaj Cas12a pa entèfere ak pwosesis obligatwa Cas12a-crRNA. Lè w ajiste konsantrasyon eparin sodyòm lan, SURVEY konpatib ak sekans PAM klasik ak ki pa pi bon epi li aplikab pou plizyè subtip Cas12. Metòd sa a, ak yon tan deteksyon sèlman 15-20 minit, reyalize yon sansiblite ak espesifik ki depase 95% pou detekte pseudoviris monkeypox, viris grip A, ak SARS-CoV-2. Li se pri ki ba-e li bay yon nouvo metòd deteksyon pwen-swen pou dyagnostik medikal jaden ak siveyans anviwònman an, adrese balans ki difisil ant sansiblite ak espesifik nan dyagnostik tradisyonèl CRISPR.
1. Etid sou mekanis nan aksyon nan sodyòm eparin
Yo te ajoute yon sond fliyoresan nan sistèm Cas12a-crRNA ki gen 10nM ADN sib, epi yo te obsève yon siyal fliyoresan rapid ak enpòtan san yo pa ajoute eparin sodyòm. Lè yo te ajoute 0.2ug/ml eparin sodyòm, siyal fliyoresan an te sanble ak gwoup kontwòl la, sa ki endike ke eparin sodyòm anpil anpeche aktivite trans-klivaj Cas12a. 0.2ug/mL eparin sodyòm se konsantrasyon minimòm inhibitor. Kòm konsantrasyon nan eparin sodyòm ogmante soti nan 0.2ug/mL a 0.5ug/mL, aktivite klivaj cis-Cas12a la piti piti anpeche, epi nan 0.5ug/mL, aktivite klivaj trans-prèske konplètman anpeche. Etid sou mekanis aksyon eparin sodyòm yo montre ke gwoup eparin sodyòm chaje negatif entèfere ak lyezon kòrèk crRNA a Cas12a, epi yo ka afekte fòmasyon konplèks binè crRNACas12a.
- MIRA-Cas12a one-pot deteksyon
Apre yo fin valide mekanis aksyon eparin sodyòm lan, papye a te eksplore yon estrateji deteksyon yon sèl-po (MIRA-Cas12a), ki te konbine anplifikasyon MIRA ak deteksyon fluoresans Cas12a-medyatè nan yon sèl tib.
Nan absans eparin sodyòm, konbinezon MIRA-Cas12a pa te pwodui okenn siyal fliyoresan enpòtan nan seri konsantrasyon jèn sib la nan 0.1aM a 10fM. Nan 40 µg/mL eparin sodyòm, yo te obsève yon siyal fliyoresan enpòtan atravè seri konsantrasyon sib la nan 1aM (≈0.6 kopi/μL, volim=30μL) a 10fM (≈6,000 kopi/μL, volim=30μL), demontre plis pase 10 fwa san konparezon nan sistèm deteksyon 000-mL. eparin.
Konsantrasyon modèl viris monkeypox la te 10 fM, epi yo te itilize Cas12a-crRNA (100 nM) pou detekte jèn sib f31 ak b6r. Reyaksyon anplifikasyon an te sispann nan 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, ak 20 minit, epi yo te analize kontni pwodwi anplifikasyon MIRA nan diferan moman sou jèl agarose. Lè sa a, pwodwi ki te lakòz yo te analize sou jèl agarose anba twa paramèt diferan: MIRA-eparin sodyòm san Cas12a, MIRA-Cas12a san yo pa eparin sodyòm, ak MIRA-Cas12a ak sodyòm eparin. Rezilta yo te montre ke nan absans sodyòm eparin, anplifikasyon asid nikleyik te anpeche akòz gwo aktivite klivaj cis - Cas12a. Sepandan, adisyon sodyòm eparin ogmante anplifikasyon asid nikleyik siyifikativman akòz rediksyon aktivite klivaj Cas12a a cis-.
Atik la demontre ke yon sèl-po inivèsèl metòd deteksyon asid nikleyè fliyoresan (SONDAJ) ki baze sou eparin sodyòm ka reyalize lè l sèvi avèk PAM klasik ak sekans PAM ki pa pi bon. Anplis de sa, anplis LbCas12a, AsCas12a ak AapCas12b yo lajman itilize tou nan metòd CRISPR -Dx. Nan sistèm ki sèvi ak MIRA-AsCas12a, yo te obsève fliyoresans sèlman nan prezans 40ug/mL eparin sodyòm, ki endike ke li ka detekte 1fM nan jèn f31 ak b6r. Nan absans eparin sodyòm, MIRA-AapCas12b ka detekte 1 jèn f31 ak b6r. Administrasyon 20ug/mL eparin sodyòm pa sèlman akselere pousantaj deteksyon MIRA-AapCas12b, men tou, amelyore entansite fliyoresans lan. Konklizyon sa yo endike ke metòd yon sèl-po devlope lè l sèvi avèk dòz eparin sodyòm aplikab tou pou lòt subtip Cas12.
